Sản xuất nước bưởi probiotic từ chủng Lactobacillus plantarum

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM


Môn học:
THỰC HÀNH PHÁT TRIỂN SẢN PHẨM THỰC PHẨM
Đề tài:
SẢN XUẤT NƯỚC ÉP BƯỞI PROBIOTIC TỪ VI KHUẨN Lactobacillus plantarum

GVHD: PGS. TS ĐÀM SAO MAI
ThS. HỒ XUÂN HƯƠNG
NHÓM SVTH: LÊ MINH CHÂU
HỒ THỊ DIỆU HẰNG
NGUYỄN THỊ LOAN
NGUYỄN THỊ YẾN LY

TP. Hồ Chí Minh, tháng 1, năm 2018
LỜI CẢM ƠN
Được sự phân công của Viện Công nghệ Sinh học – Thực phẩm trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh và sự hướng dẫn của cô Đàm Sao Mai chúng em đã thực hiện báo cáo thực hành môn Phát triển sản phẩm thực phẩm.
Để làm được bài báo cáo này, chúng em xin chân chân thành cảm ơn các thầy cô giáo đã tận tình hướng dẫn, giảng dạy và tạo điều kiện tối đa cho chúng em trong suốt quá trình học tập, rèn luyện tại trường Đại học Công nghiệp TP. Hồ Chí Minh.
Chúng em xin chân thành cảm ơn giáo viên hướng dẫn Đàm Sao Mai đã tận tình, chu đáo hướng dẫn để chúng em có thể hoàn thành tốt bài báo cáo này.
Mặc dù rất cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất, song do sự hạn hẹp về thời gian và kiến thức, kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu sót mà bản thân chưa thể nhận thấy được. Chúng em rất mong nhận được sự góp ý của cô và các bạn để dự án này có thể hoàn chỉnh hơn.
Chúng em xin chân thành cảm ơn!
NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN























TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM


MÔN THỰC HÀNH PHÁT TRIỂN SẢN PHẨM

DANH SÁCH THÀNH VIÊN

STT HỌ VÀ TÊN MSSV KÍ TÊN
1 Lê Minh Châu 14013941
2 Hồ Thị Diệu Hằng 14080211
3 Nguyễn Thị Loan 14065431
4 Nguyễn Thị Yến Ly 14071451
 
MỤC LỤC
1. Giới thiệu sản phẩm 1
2. Tổng quan về nguyên liệu 2
2.1. Bưởi 2
2.2. Lactobacillus plantarum 4
3. Qui trình công nghệ dự kiến 6
3.1. Rửa: 6
3.2. Xử lý sơ bộ: 7
3.3. Nghiền, lọc: 7
3.4. Khử đắng: 7
3.5. Phối trộn: 8
3.6. Thanh trùng: 8
3.7. Lên men: 8
3.8. Lọc: 9
3.9. Chiết rót: 9
3.10. Làm lạnh: 9
4. Bố trí thí nghiệm 9
5. Tính giá thành sản phẩm 15



1. Giới thiệu sản phẩm
Việt Nam là một nước nhiệt đới nên có ưu thế về các loại trái cây như: Xoài, mãng cầu, thanh long, cam, bưởi,… Quả bưởi là đặc sản của nước ta, nó có giá trị dinh dưỡng cao và tác dụng tốt đối với sức khỏe con người. Mặc dù có rất nhiều quan điểm cho rằng trái cây ăn tươi vẫn tốt hơn là đã qua chế biến, thế nhưng với cuộc sống hiện đại hóa, tất bật ngày nay của con người thì nước trái cây đóng chai vẫn được nhiều người ưa chuộng với sự tiện lợi của nó, con người vẫn có thể dễ dàng thưởng thức loại trái cây mà mình ưa thích dưới dạng nước uống mà không cần tốn nhiều thời gian. Trong các loại trái cây đó, bưởi là loại trái cây được rất nhiều người ưa thích và lựa chọn bởi các lợi ích sức khỏe cực kỳ tốt. So với các loại nước uống khác, nước ép bưởi là sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, có tính giải nhiệt tốt. Ngoài ra, xu hướng sử dụng nước ép bưởi lên men hiện nay tăng khá cao.
Ngày nay thức uống có bổ sung probiotic có nguồn gốc không phải là sữa đã trở nên phổ biến. Việc phát triển các sản phẩm probiotic này đóng vai trò quan trọng trong việc đa dạng hóa thị trường và đáp ứng nhu cầu của những người không hấp thụ được các sản phẩm có nguồn gốc từ sữa. Probiotics là nhóm những vi khuẩn có lợi cho sức khỏe, điển hình như nhóm vi khuẩn lactic Bifidobacterium và vi khuẩn Lactobacillus có trong hệ vi sinh vật đường ruột. Probiotic mang rất nhiều lợi ích khác nhau như kiểm soát vi khuẩn có hại, trợ giúp đắc lực cho hệ miễn dịch của ruột,… Do các công dụng hữu ích trên mà probiotic đã và đang được xem là một trong những vấn đề cần quan tâm và nghiên cứu nhiều hơn nữa để ứng dụng vào cuộc sống của con người. Ở Việt Nam các sản phẩm bổ sung probiotic còn rất hạn chế, chủ yếu được bổ sung vào sữa. Trong khi đó nước trái cây có thể xem như một môi trường tốt để nuôi dưỡng những chế phẩm sinh học bởi vì chúng rất giàu chất chống oxi hóa, vitamin, chất xơ ăn được và khoáng chất. Chính vì vậy nghiên cứu để sản xuất ra nước ép bưởi lên men sử dụng vi khuẩn có ý nghĩa thực tiễn cao, sẽ góp phần mở rộng thị trường tiêu thụ cho quả bưởi, thúc đẩy thị trường xuất khẩu nước giải khát của nước ta tăng trưởng nhanh chóng đồng thời khắc phục được những nhược điểm của nước ép bưởi thông thường. Xuất phát từ những ý tưởng trên nên chúng tôi quyết định “ Nghiên cứu sản xuất nước ép bưởi probiotic từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum”.
Thông tin sản phẩm:
Tên sản phẩm: MAXBI
Thành phần: Nước ép bưởi, đường, probiotic.
Bao bì: Bao bì PE thể tích 60ml.

Chức năng sản phẩm: Đồ uống trái cây lên men lactic, cung cấp lượng lớn lợi khuẩn đường ruột hỗ trợ tiêu hóa.
Thuộc tính sản phẩm: Màu vàng nhạt, đục, có vị đắng nhẹ hơi the, hương thơm đặc trưng của sản phẩm lên men.
2. Tổng quan về nguyên liệu
2.1. Bưởi
Cây bưởi có tên khoa học là: Citrus grandis L. hay Citrus maxima. Thuộc họ cam quýt (Rutaceae).
Bưởi là một loại cây ăn trái quen thuộc với người Việt Nam. Hương hoa bưởi thơm ngát. Đặc biệt là từ lá đến hoa, từ múi bưởi tới vỏ ngoài của quả bưởi đều có khả năng chữa bệnh. Bưởi là trái cây ăn trái giàu dinh dưỡng: đường, đạm, chất béo, đặc biệt là chứa rất nhiều vitamine B1, B2, C.
Cây bưởi có đặc điểm là cây cao to từ 5–15m, đường kính từ 10–30 cm vỏ thân màu vàng nhạt, cành có gai dài, nhọn ở kẽ lá. Lá có hình trứng hoặc hình trái xoan, mọc so le, hoa to gồm 4-5 cánh mọc thành chùm 6–10 hoa, màu trắng rất thơm, quả hình cầu, vỏ màu xanh đến vàng, bên trong là các múi chứa các tép mọng nước. Hạt dẹp có cạnh và pectin chất bao quanh (Morton, 1987). Lá và vỏ quả có chứa rất nhiều tinh dầu thơm. Bưởi được trồng khắp nơi ở Việt Nam. Có nhiều giống bưởi với màu sắc, vị chua ngọt khác nhau. Nổi tiếng là các giống bưởi Đoan Hùng (Phú Thọ), Phúc Trạch (Hà Tĩnh), Biên Hòa (Đồng Nai), Năm Roi (Vĩnh Long), Da Xanh (Bến Tre),… Cây bưởi đựơc trồng chủ yếu để lấy quả ăn, lấy hoa ướp thơm thực phẩm, hoặc cất nước hoa bưởi. Ngoài ra người ta còn dùng lá làm thuốc. Hiện nay vỏ bưởi và hạt bưởi cũng được sử dụng để làm các vị thuốc chữa bệnh, và tách chiết pectin.
Bưởi Năm Roi
Hiện nay diện tích trồng bưởi Năm Roi ở nước ta là 9.200 ha, phân bố nhiều nhất là ở tỉnh Vĩnh Long. Tại tỉnh Vĩnh Long có 4.500 ha chiếm 48,6 % tổng diện tích và cho sản lượng 31.300 tấn chiếm 54,3% tập trung nhiều nhất ở huyện Bình Minh. Đứng sau Vĩnh Long là tỉnh Hậu Giang với diện tích trồng là 1.300 ha (Kỹ sư Hồ Đình Hải, 2014). Thời gian trồng từ tháng tư cho đến tháng giêng. Đặc điểm của bưởi Năm Roi là quả hình quả lê, trọng lượng trung bình từ 1-1,4 kg/trái, khi chín quả có màu vàng xanh, thịt quả màu vàng, múi và vách múi rất dễ tách, ăn giòn, ngọt, thơm, vị hơi chua, ít hạt, và hạt lép nhỏ li ti. Tỷ lệ phần ăn được trên 55%, độ Brix từ 9-12. Thời điểm thu hoạch bắt đầu từ tháng 9 dương lịch. Bưởi Năm Roi hiện tại đã được mở rộng mạng lưới phân phối trên toàn quốc, trong đó thành phố Hồ Chí Minh là tiêu thụ mạnh nhất. Ngoài ra còn được xuất khẩu sang thị trường Đông Âu, Pháp, Đức.
Thành phần hóa học của quả bưởi
Bảng 1. Thành phần hóa học trong 100g bưởi ăn được.
(Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ USDA)
Thành phần Đơn vị Lượng có trong 100g Thành phần Đơn vị Lượng có trong 100g
Năng lượng Kcal 38 Sắt (Fe) mg 0.5
Nước g 89.7 Kẽm (Zn) mg 0.32
Protein tổng số g 0.2 Cobalt (Co) mcg 1.1
Protein thực vật g 0.2 Flour (F) mcg 30
Glucide tổng số g 7.3 Beta Carotene mcg 30
Cellulose g 0.7 Vitamine B1 mg 0.04
Tro mg 0.4 Vitamine B2 mg 0.02
Natrium (Na) mg 1 Vitamine B6 mg 0.04
Kalium (K) mg 235 Vitamine PP mg 0.3
Calcium (Ca) mg 23 Vitamine C mg 95
Phospho (P) mg 18 Acid hữu cơ g 1.7
Bưởi Năm Roi có ở vùng Nam Bộ, gần với địa điểm thực hiên nghiên cứu. Đây là một giống bưởi được được đánh giá là nhiều nước và thường được sử dụng để tạo các sản phẩm nước ép bưởi. Do đó, chúng tôi sử dụng bưởi Năm Roi để tiến hành nghiên cứu này.
Phần lớn các polyphenol có trong chế độ ăn sẽ không được hấp thụ vào ruột non và có thể tương tác với vi khuẩn ở kết tràng (Dueñas, 2015). Các polyphenol và các chất chuyển hóa của chúng có thể điều chỉnh thành phần vi sinh vật có hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn gây bệnh đường ruột và kích thích những vi khuẩn có lợi phát triển. Tuy nhiên, theo sự tìm hiểu của chúng tôi, những ảnh hưởng của quả cam bergamot đối với các vi khuẩn có lợi trong ruột hiện nay không có trong tài liệu (Morena Gabriele, 2017). Kết quả nghiên cứu của Morena Gabriele et al. cho thấy chiết xuất bergamot (có chứa naringin và hesperidin) không có hoạt tính chống vi khuẩn đối với vi khuẩn có lợi có trong ruột thuộc các loại Bifidobacterium và Lactobacillus. Các chủng B. breve B632 đã không bị ức chế; trái lại, nó đã được kích thích nhẹ bởi các lượng lớn hơn 100 mg/mL. Sự tăng trưởng của các chủng Lactobacillus không bị ảnh hưởng bởi dịch chiết bergamot, ngoại trừ sự ức chế nhẹ đối với các dòng L. reuteri ở nồng độ cao nhất được khảo sát. Ngược lại, sự gia tăng tế bào tăng nhẹ được ghi nhận đối với các dòng L. plantarum. Do đó việc sử dụng các chủng L. plantarum để lên men lactic nước ép bưởi là hoàn toàn có thể.
2.2. Lactobacillus plantarum
Probiotics là những vi sinh vật sống có ảnh hưởng tốt đến vật chủ bằng cách giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột (Michail S, 2005). Có hơn khoảng 100.000 tỉ vi khuẩn trong hệ đường ruột, chúng bao gồm cả vi sinh vật có lợi như các loài thuộc nhóm Lactobacillus, Staphylococcus,... và các vi sinh vật gây hại như Clotridium, Staphylococcus,... Các vi sinh vật có lợi sẽ có tác động có lợi cho sức khỏe như là tổng hợp vitamin, giảm sự hình thành các chất gây hại trong ruột, hỗ trợ tiêu hóa cũng như tăng cường sức đề kháng giúp phòng bệnh. Ngược lại, các vi sinh vật gây hại sẽ gây ra những tác động xấu cho cơ thể như hình thành các chất gây hoại tử trong ruột, các chất gây ung thư,... Vì vậy, sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột là rất quan trọng để duy trì lượng vi sinh vật có lợi. Một probiotic được dùng cho sản xuất thực phẩm, đặc biệt là thực phẩm chức năng cần phải thỏa mãn các yêu cầu chịu được acid của dạ dày và dịch mật để tiến tới ruột non mà vẫn có thể vẫn tồn tại, phát triển và an toàn khi sử dụng. Các loài vi sinh vật được sử dụng để sản xuất thực phẩm probiotic chủ yếu là các vi sinh vật thuộc hai chi Lactobacillus và Bifidobacteria bởi vì chúng được xem là an toàn và có lợi cho sức khỏe.
Lactobacillus plantarum (L. plantarum) là một vi khuẩn sinh acid lactic có hình que, gram dương. Nó thường xuất hiện trong các đường tiêu hoá, nước bọt và các sản phẩm thực phẩm khác của người và động vật có vú khác. Nó có thể phát triển ở nhiệt độ từ 15-45°C và độ pH thấp 3,2. L. plantarum sản sinh ra acid lactic, ethanol hoặc acid acetic và carbon dioxide trong điều kiện nhất định và các chất nền có chọn lọc. Tùy thuộc vào nguồn carbon, các vi khuẩn này có thể chuyển đổi từ việc sử dụng các phương pháp chuyển hóa dị hình và đồng hình. Vi khuẩn này có khả năng kháng acid và muối mật, nên nó có thể tồn tại ở đường tiêu hóa của con người. L. plantarum hiện đang được quan tâm bởi các nhà nghiên cứu và ngành công nghiệp thực phẩm vì nó được xem là một loại probiotic an toàn. Nó có thể giúp hạn chế số lượng các vi khuẩn gây bệnh hoặc các bệnh có tác động tiêu cực nào đó đến cơ thể người. Ngoài ra, các nghiên cứu gần đây cho thấy L. plantarum có thể được sử dụng như một loại vacin.
L. plantarum thường được sử dụng trong sản xuất sữa, thịt, và lên men thực vật, và được tìm thấy trong các sản phẩm thực phẩm như sữa chua, phô mai, kim chi, bắp cải, và dưa chua. Vi khuẩn này làm cho thức ăn hương vị nhất định tùy thuộc vào sự cân bằng giữa acid hữu cơ acetate (bay hơi) và acid hữu cơ lactate (không bay hơi). Bằng cách sử dụng oxy và sục khí vào thực phẩm, người sản xuất có thể kiểm soát lượng acid acetic được sinh ra như là sản phẩm cuối cùng lên men. Một ví dụ của việc này là lên men chua. Các sản phẩm bảo quản tự nhiên ngày càng là mong muốn của người tiêu dùng. Do đó, các nhà khoa học đang nghiên cứu vi khuẩn lactic kháng nấm và các đặc tính bảo quản của chúng. Vì vi khuẩn acid lactic thường có thể tồn tại ở phạm vi nhiệt độ, mức độ pH thích, nơi một số nấm men bị hư hỏng thường được tìm thấy trong thực phẩm, vi khuẩn acid lactic đang được nghiên cứu để xác định xem chúng có thể ức chế sự phát triển của men không mong muốn. L. plantarum, có khả năng kháng khuẩn và kháng nấm nhờ việc tạo ra các chất như acid, hydrogen perocide và bacteriocins, là những chất có tiềm năng rất lớn như chất bảo quản thực phẩm.
L. plantarum có hệ enzyme rất phong phú: Amylase, β-glucosidase, decarboxylase, lactate, dehydrogenase, peptidase, phenolic acid decarboxylase, phenol reductase, proteinase, tannase (Fermented Foods as a Source of Healthy Constituents, Chap 4). Các enzyme này trong quá trình lên men có thể thủy phân glucosides, phá vỡ thành tế bào thực vật hoặc tinh bột, đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy các tế bào tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết flavonoid (Juana Frias et al., 2017).
Vi khuẩn acid lactic được sử dụng rộng rãi trong quá trình lên men thực phẩm, và L. plantarum là loài được sử dụng nhiều nhất để lên men các sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc thực vật nơi các hợp chất phenolic phong phú như lên men sữa từ hạt navy bean, lên men rau mầm,…


3. Qui trình công nghệ dự kiến

Sơ đồ 1. Quy trinh sản xuất sản phẩm nước ép bưởi.
Thuyết minh quy trình
3.1. Rửa:
Mục đích: làm sạch nguyên liệu chuẩn bị cho công đoạn tiếp theo.
Tiến hành: rửa bằng phương pháp thủ công. Để nguyên trái rửa xối dưới vòi nước.
Yêu cầu: đảm bảo vệ sinh, nguyên liệu sạch, an toàn.
3.2. Xử lý sơ bộ:
Mục đích: loại bỏ vỏ, hạt để chuẩn bị cho công đoạn tiếp theo.
Tiến hành: tiến hành loại bỏ vỏ và hạt bằng phương pháp thủ công. Tách lớp vỏ xanh, vỏ trắng và hạt của bưởi, chỉ lấy phần thịt quả.
Yêu cầu:
- Đảm bảo vấn đề vệ sinh.
- Nguyên liệu phải đảm bảo không còn vỏ, hạt tránh ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm.
Biến đổi:
- Vật lý: thay đổi kích thước, giảm khối lượng.
- Vi sinh: tăng số lượng vi sinh vật do vi sinh vật nhiễm từ môi trường bên ngoài vào nguyên liệu.
3.3. Nghiền, lọc:
Mục đích: phá vỡ cấu trúc bưởi, chuyển sang dạng dịch lỏng.
Tiến hành: đưa vào máy nghiền, sau khi nghiền tiến hành lọc.
Yêu cầu: Nghiền: hỗn hợp sệt, đồng nhất, có kích thước đồng đều.
Lọc: không còn cặn, dịch đồng nhất
Biến đổi:
Vật lý: giảm khối lượng, thay đổi trạng thái từ rắn sang lỏng.
3.4. Khử đắng:
Mục đích: giảm vị đắng trong bưởi.
Tiến hành: dùng enzyme naringinase hoặc bằng phương pháp trao đổi ion.
 Dùng enzyme naringinase
Bổ sung enzym vào trong dịch bưởi với tỷ lệ và thời gian đã khảo sát.
 Phương pháp trao đổi ion.
Dịch bưởi được lọc qua lớp hạt resin với các thông số đã khảo sát.
Yêu cầu: nước bưởi đạt trạng thái cảm quan.
Biến đổi:
- Vật lý: dịch bưởi trong hơn.
- Hóa học: naringin chuyển thành prunin, naringenin.
- Hóa sinh: giảm hàm lượng enzyme naringinase.
- Hóa lý: xảy ra sự trao đổi ion ( nếu dùng phương pháp trao đổi ion).
3.5. Phối trộn:
Mục đích: dịch quả đủ điều kiện để chuẩn bị cho công đoạn tiếp theo, tăng giá trị sản phẩm, nâng cao giá trị dinh dưỡng.
Tiến hành: dịch quả sau khi được khử đắng sẽ được phối chế với đường với tỷ lệ khảo sát..
Yêu cầu: theo nồng độ tối ưu đã khảo sát.
Biến đổi:
- Vật lý: tăng thể tích.
- Cảm quan: đạt trạng thái cảm quan.
3.6. Thanh trùng:
Mục đích: tiêu diệt vi sinh vật có trong dịch quả, tối ưu hóa điều kiện cho quá trình lên men.
Tiến hành: tiến hành thanh trùng theo chế độ tối ưu đã khảo sát.
Yêu cầu: đúng thời gian, đúng nhiệt độ, vi sinh vật bị tiêu diệt toàn bộ.
Biến đổi:
- Vi sinh: vi sinh vật bị tiêu diệt.
- Hóa sinh: enzym bị vô hoạt.
3.7. Lên men:
Mục đích: lên men dịch bưởi, tạo ra sản phẩm có giá trị cao.
Tiến hành: bổ sung nấm men Lactobacillus plantarum và Lactobacillus fermentum, khuấy đều và rót vào bình lên men, tiến hành lên men ở chế độ tối ưu đã khảo sát.
Yêu cầu: Nắp kín, tránh bị vi sinh vật xâm nhập, hay trong quá trình lên men bị không khí tràn vào.
Biến đổi:
- Hóa học: dưới tác dụng của nấm men, đường có trong dịch bưởi sẽ chuyển hóa thành rượu.
- Vật lý: tăng nhiệt độ, pH giảm.
- Hóa sinh: nấm men phát triển.
3.8. Lọc:
Mục đích: làm dịch quả trong hơn, không lẫn cặn.
Tiến hành: lọc qua máy lọc, có lót giấy lọc.
Yêu cầu: dịch quả trong, không lẫn cặn, an toàn vệ sinh.
Biến đổi: dịch quả trong, thể tích giảm không đáng kể.
3.9. Chiết rót:
Mục đích: đóng gói thành phẩm.
Tiến hành: rót dịch quả vào chai. Đóng nắp kín.
Yêu cầu: các chai có kích thước xác định, chịu được nhiệt độ, áp suất cao, nắp chai kín.
3.10. Làm lạnh:
Mục đích: tránh hiện tượng nấm men sẽ tiếp tục lên men.
Tiến hành: tiến hành làm lạnh ở 150C.
Yêu cầu: đảm bảo không thay đổi tính chất cảm quan sản phẩm.
4. Bố trí thí nghiệm
4.1. Xác định một số thành phần trong nguyên liệu bưởi
Bảng 2. Khảo sát tỉ lệ các thành phần trong 100ml dịch bưởi ép.
STT Thành phần Đơn vị
1 Đường tổng mg
2 Độ acid mg
3 Tro mg
4 Protein mg
4.2. Khảo sát quá trình khử đắng bằng cột trao đổi ion
Bảng 3. Khảo sát ảnh hưởng của chiều cao cột ion đến hàm lượng naringin.
Chiều cao cột (cm) Hàm lượng naringin
20
30
40
50
Bảng 4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lưu dịch trong cột ion đến hàm lượng naringin.
Thời gian Hàm lượng naringin
10
20
30
40

Xác định hàm lượng naringin: bằng máy quang phổ theo phương pháp của Davis (1947).
Chuẩn bị mẫu: Lấy 0.1 ml dịch lọc (sử dụng giấy lọc Whatman 1) cho vào ống nghiệm, thêm 0.1 ml dung dịch NaOH 4N, sau đó thêm 5 ml diethylene glycol 90%, làm đều mẫu bằng máy Votex và để yên trong 10 phút. Sau đó, cho vào cuvet đem đo màu. Mật độ quang được đọc tại bước sóng 420 nm bằng máy đo quang phổ. Hàm lượng naringin được xác định dựa vào đường chuẩn naringin (Nguyễn Kim Thiên, 2010).
Chuẩn bị mẫu trắng: thực hiện tương tự nhưng thay mẫu bằng nước cất.
Từ kết quả thu được ta lập được phương trình đường chuẩn, từ đó có thể tính được nồng độ Naringin trong các mẫu.
4.3. Khảo sát đường cong sinh trưởng
Chủng vi khuẩn L. plantarum được tăng sinh, pha loãng và cấy vào môi trường MRS tối ưu để có được mật độ ban đầu trong bình môi trường là 106 CFU/ml. Sau đó tiến hành khảo sát sự tăng trưởng của L. plantarum tại các thời điểm 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 giờ. Tại mỗi thời điểm tiến hành thu mẫu và khảo sát các chỉ tiêu mật độ vi khuẩn bằng cách đo OD600nm, sự thay đổi pH, và tổng vi khuẩn lactic trong môi trường tối ưu (Lê Ngọc Thùy Trang, Phạm Minh Nhựt, 2014).
Bảng 5. Khảo sát đường cong sinh trưởng.
Thời gian (giờ) Tổng khuẩn lạc (CFU/ml) Độ hấp thu pH
0
2
4
6
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Lặp lại thí nghiệm 3 lần và chọn khoảng thời gian cả độ hấp thu A và số lượng khuẩn lạc cao nhất và ít biến động.
4.4. Khảo sát ảnh hưởng của độ Brix dịch lên men
Mật độ tế bào vi khuẩn sẽ tăng dần khi tăng nồng độ cơ chất trong khoảng nhất định. Nồng độ cơ chất cao thì lượng thức ăn cho vi khuẩn nhiều, đáp ứng được nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn trong quá trình sinh trưởng và phát triển và ngược lại.
Bảng 6. Khảo sát ảnh hưởng của độ Brix dịch lên men.
Độ Brix Mật độ tế bào trước lên men (N/ml) Mật độ tế bào sau lên men (N/ml)
15
17
19
21
Lặp lại thí nghiệm 3 lần và chọn độ Brix mà tại đó mật độ tế bào cao nhất và sản phẩm cho giá trị cảm quan tốt nhất.
Cách xác định mật độ tế bào: Phương pháp định lượng trực tiếp qua cách đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu.
Buồng đếm hồng cầu thường là một phiến kính dày 2 - 3 mm có một vùng đĩa đếm nằm giữa phiến kính và được bao quanh bởi một rãnh. Đĩa đếm thấp hơn bề mặt của phiến kính khoảng 1/10 mm, có hình tròn vì thế khi được phủ lên bằng mộto lá kính thì độ sâu của đĩa đếm sẽ đồng đều nhau. Vùng đĩa đếm có diện tích 1mm2 và được chia thành 25 ô vuông lớn có diện tích mỗi ô là 1/25 mm2 và 400 ô vuông nhỏ hơn, mỗi ô có diện tích 1/400 mm2 Khi thực hiện quan sát và đếm vi sinh vật, cho thêm vài giọt formalin vào trong mẫu, trộn đều. Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5 - 10 tế bào vi sinh vật. Để đạt được độ pha loãng như vậy cần phải ước lượng được số lượng vi sinh vật trong mẫu, đồng thời phải thử vài lần trong quá trình pha loãng. Mẫu phải được pha loãng bằng dung dịch pha loãng chứa 0,1% pepton và 0,1% laurylsulphate và 0,01% methyl blue. Tất cả các dung dịch pha loãng đều cần phải được lọc trước khi sử dụng. Đặt một giọt mẫu được pha loãng vào vùng đếm trên buồng đếm ở khu vực buồng đếm. Chỉnh thị trường sao cho một thị trường chứa trọn một ô lớn (4 x 4 = 16 ô nhỏ). Đếm số tế bào hiện diện trong 1 ô lớn. Sau đó, chỉnh thị trường tìm 1 ô lớn khác. Đếm số tế bào của ít nhất 5 ô lớn. Lấy trị số trung bình.
Cách tính mật độ tế bào như sau : thể tích của một ô lớn là 1/25mm2 x 1/10m = 1/250mm3 hay 1/250 x 103 cm3 = 4 x 10-6 ml. Như vậy, mật độ tế bào của huyền phù mẫu là : N/ml = 0,25a x 106 tế bào/ml (trong đó a là số tế bào bình quân trong một ô lớn)

4.5. Khảo sát sự ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men
Bảng 7. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men.
pH Mật độ tế bào trước lên men (N/ml) Mật độ tế bào sau lên men (N/ml)
5
5.5
6
6.5
Lặp lại thí nghiệm 3 lần và chọn mức pH mà tại đó mật độ tế bào cao nhất.
Cách xác định mật độ tế bào: Phương pháp định lượng trực tiếp qua cách đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu.
Khi thực hiện quan sát và đếm vi sinh vật, cho thêm vài giọt formalin vào trong mẫu, trộn đều. Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5 - 10 tế bào vi sinh vật. Để đạt được độ pha loãng như vậy cần phải ước lượng được số lượng vi sinh vật trong mẫu, đồng thời phải thử vài lần trong quá trình pha loãng. Mẫu phải được pha loãng bằng dung dịch pha loãng chứa 0,1% pepton và 0,1% laurylsulphate và 0,01% methyl blue. Tất cả các dung dịch pha loãng đều cần phải được lọc trước khi sử dụng. Đặt một giọt mẫu được pha loãng vào vùng đếm trên buồng đếm ở khu vực buồng đếm. Chỉnh thị trường sao cho một thị trường chứa trọn một ô lớn (4 x 4 = 16 ô nhỏ). Đếm số tế bào hiện diện trong 1 ô lớn. Sau đó, chỉnh thị trường tìm 1 ô lớn khác. Đếm số tế bào của ít nhất 5 ô lớn. Lấy trị số trung bình.
Cách tính mật độ tế bào như sau : thể tích của một ô lớn là 1/25mm2 x 1/10m = 1/250mm3 hay 1/250 x 103 cm3 = 4 x 10-6 ml. Như vậy, mật độ tế bào của huyền phù mẫu là : N/ml = 0,25a x 106 tế bào/ml (trong đó a là số tế bào bình quân trong một ô lớn)

4.6. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men
Quá trình lên men nước ép bưởi được nghiên cứu với mục đích thu được sản phẩm probiotic nước ép bưởi có số lượng vi khuẩn Lactobacillus plantarum đạt cao nhất và sản phẩm thu được đạt giá trị cảm quan tốt nhất. Chúng tôi khảo sát với thời gian lần lượt là 12h, 24h, 36h, 48h với độ Brix thích hợp đã khảo sát trên thí nghiệm 3.4. Các thông số cần theo dõi là nồng độ acid lactic, pH.
Bảng 8. Ảnh hưởng của thời gian đến mật độ tế bào vi khuẩn Lactobacillus plantarum.
12h 24h 36h 48h
Nồng độ acid lactic
pH
Lượng vi khuẩn (N/ml)
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và chọn mốc thời gian cho mật độ vi khuẩn L. plantarum cao nhất.
Cách xác định mật độ tế bào: Phương pháp định lượng trực tiếp qua cách đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu.
Khi thực hiện quan sát và đếm vi sinh vật, cho thêm vài giọt formalin vào trong mẫu, trộn đều. Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5 - 10 tế bào vi sinh vật. Để đạt được độ pha loãng như vậy cần phải ước lượng được số lượng vi sinh vật trong mẫu, đồng thời phải thử vài lần trong quá trình pha loãng. Mẫu phải được pha loãng bằng dung dịch pha loãng chứa 0,1% pepton và 0,1% laurylsulphate và 0,01% methyl blue. Tất cả các dung dịch pha loãng đều cần phải được lọc trước khi sử dụng. Đặt một giọt mẫu được pha loãng vào vùng đếm trên buồng đếm ở khu vực buồng đếm. Chỉnh thị trường sao cho một thị trường chứa trọn một ô lớn (4 x 4 = 16 ô nhỏ). Đếm số tế bào hiện diện trong 1 ô lớn. Sau đó, chỉnh thị trường tìm 1 ô lớn khác. Đếm số tế bào của ít nhất 5 ô lớn. Lấy trị số trung bình.
Cách tính mật độ tế bào như sau : thể tích của một ô lớn là 1/25mm2 x 1/10m = 1/250mm3 hay 1/250 x 103 cm3 = 4 x 10-6 ml. Như vậy, mật độ tế bào của huyền phù mẫu là : N/ml = 0,25a x 106 tế bào/ml (trong đó a là số tế bào bình quân trong một ô lớn)

4.7. Đánh giá trên môi trường dịch vị và dịch mật theo thời gian

Sơ đồ 2. Sơ đồ đánh giá sản phẩm trên môi trường dịch vị và dịch mật theo thời gian.
Nước ép bưởi probiotic sau quá trình lên men, được đưa vào môi trường ruột giả để đánh giá hiệu quả của sản phẩm.
Theo phương pháp truyền thống, 1ml dịch nuôi cấy vi khuẩn ở cuối pha sinh trưởng được ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút để thu tế bào. Tế bào đã loại bỏ môi trường nuôi cấy sau đó được trộn với dịch dạ dày mô phỏng gồm glucose (3.5 g/lít), NaCl (2.05 g/lít), KH2PO4 (0.60 g/lít), CaCl2 (0.11 g/lít), và KCl (0.37 g/lít) được chuẩn độ về các pH 2.0 bằng dung dịch HCl 1M và lọc bằng màng lọc 0.2µm. Sau đó lysozyme (0.1 g/lít) và pepsin (13.3 mg/lít) được cho vào dịch gốc trước khi tiến hành thí nghiệm (Corcoran et al., 2005). Dịch mật lợn và dịch mật gà tươi đã được lọc vô khuẩn cũng được sử dụng làm thí nghiệm tương tự vì đã có nghiên cứu cho thấy việc thay thế này có thể phản ánh khả năng chịu muối mật của người (Dunne et al., 2001). Sau khi ủ vi khuẩn cần kiểm định với 1ml các dịch kể trên trong 2 giờ, dịch vi khuẩn đã xử lý được cấy vạch bằng tăm gỗ tiệt trùng lên trên đĩa thạch chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp để so sánh tốc độ sinh trưởng so với các mẫu đối chứng trong nước và được cất giữ ở 400C. Tỉ lệ sống sót của một số chủng vi khuẩn cũng đã được xác định bằng phương pháp cấy trải trên đĩa thạch và đếm khuẩn lạc.
4.7. Phương pháp đánh giá cảm quan sản phẩm
Bảng 9. Bảng đánh giá cảm quan sản phẩm.
Chỉ tiêu Mức điểm Hệ số quan trọng Yêu cầu
Màu sắc 5
4
3
2
1 0.8 Màu vàng nhạt, hơi đục
Màu vàng nhạt, đục
Màu vàng lợt, đục nhiều
Màu vàng lợt, rất ít đục
Có màu lạ, bị lỗi
Vị 5
4
3
2
1 1.6 Vị ngọt dịu, chua nhẹ hòa quyện, không có vị lạ
Vị ngọt dịu, chua nhẹ, không có vị lạ
Vị ngọt gắt/chua gắt, không có vị lạ
Có vị ngọt và chua rất nhạt, hơi có vị cỏ
Có vị cỏ đặc trưng, mất hoàn toàn vị bưởi
Mùi 5
4
3
2
1 1.2 Mùi thơm rất đặc trưng của bưởi lên men, không có mùi lạ
Có vị thơm của bưởi lên men, không có mùi lạ
Có vị thơm rất nhẹ của bưởi lên men, không có mùi lạ
Hầu như không có mùi thơm của bưởi, có mùi sản phẩm lên men
Mất hoàn toàn mùi bưởi và sản phẩm lên men, có mùi hôi
Trạng thái 5
4
3
2
1 0.4 Sản phẩm không bị lắng, không nhớt
Sản phẩm lắng ít, không nhớt
Sản phẩm lắng ít, nhớt
Sản phẩm lắng nhiều, nhớt
Sản phẩm tách lớp, nhớt
5. Tính giá thành sản phẩm
Bảng 10. Tính giá thành cho một chai nước bưởi probiotic MAXBI thể tích 60ml.
STT Tên Đơn giá (VNĐ) Số lượng Tiền
(VNĐ)
1 Bưởi 19000/kg 42ml 1773
2 Đường 20000/kg 7,8g 156
3 Nước 714/lít 18ml 12.852
4 Vi khuẩn Lactobacillus plantarum 1000000/con 100
5 Môi trường MRS 960000/kg 1 đĩa petri (10ml) 656.04
6 Agar 10000/25g 1 đĩa petri (10ml)
7 Bao bì 200/bao bì 1 cái 200
8 Nhãn 50/nhãn 1 cái 50
9 Enzyme pectinase 3400/ml 0.0126ml 42.84
10 Hạt nhựa trao đổi ion 60000/kg 84ml (75.6g)
(Tái sử dụng 5 lần) 4536
(907.2)
Tổng 3797.932